質(zhì)粒DNA分離和純化

質(zhì)粒DNA分離和純化：
純化要求
質(zhì)粒DNA中不應(yīng)存在對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性有抑制作用的有機(jī)溶
劑分子或過(guò)高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多
糖、脂類、基因組和RNA的污染。不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)于質(zhì)粒純度的
要求不同，常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（如酶切、測(cè)序等）普通純度的質(zhì)粒
即可滿足實(shí)驗(yàn)，而對(duì)于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，要求質(zhì)粒的純度較高（如高純度或無(wú)
內(nèi)毒素）。可以選擇不同的質(zhì)粒提取試劑盒以滿足不同的實(shí)驗(yàn)要求。
純化方法
用硅基質(zhì)材料吸附質(zhì)粒DNA來(lái)代替乙醇沉淀的純化方式，提取的質(zhì)
粒純度高、操作方便快捷，可選擇的試劑盒有兩種類型，即普通質(zhì)
粒提取試劑盒和無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒。
質(zhì)粒DNA的洗脫和收集
參見(jiàn)基因組DNA提取
質(zhì)粒的保存
溶解在洗脫液TE中的質(zhì)粒DNA，也可以貯存在TE緩沖液中（用水溶
解的質(zhì)粒只能短期保存，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室用的純水呈弱酸性，質(zhì)粒在
酸性環(huán)境下會(huì)發(fā)生磷酸解），4℃短期保存或-20℃和-70℃長(zhǎng)期保
存，也可在含有質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物中，加等體積甘油，于-70℃保
存 。
質(zhì)粒鑒定與評(píng)價(jià)：
瓊脂糖電泳檢測(cè)
堿裂解法提取的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定時(shí)，理想狀況是只出現(xiàn)
超螺旋—條帶，但在質(zhì)粒提取過(guò)程中，由于機(jī)械力、酸堿度、試劑
等原因，使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂，可能出現(xiàn)兩條帶或者出現(xiàn)三條
帶，這三條帶電泳遷移率從快到慢，分別是超螺旋、開(kāi)環(huán)和復(fù)制中
間體（即沒(méi)有復(fù)制*的兩個(gè)質(zhì)粒粘連在—起）。如果加溶液Ⅱ后過(guò)
度振蕩，會(huì)在遠(yuǎn)離這三條帶的位置出現(xiàn)條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，
是大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時(shí)候提取的質(zhì)粒
會(huì)出現(xiàn)4個(gè)以上的條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度
的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。但是，只要質(zhì)粒經(jīng)單酶切鑒定
后，只有單一條帶，就證明沒(méi)有基因組的污染。
酶切檢測(cè)
質(zhì)粒提取后，為了進(jìn)—步鑒定質(zhì)粒的正確與否，就要進(jìn)行酶切鑒
定，通過(guò)與Marker對(duì)比，確定質(zhì)粒的分子量大小。
用紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)
濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)為：OD260值為1相當(dāng)于大約50ug/ml雙鏈DNA。OD260/
OD280比值在1.7-1.9之間說(shuō)明所得DNA純度較好。OD260/OD280比值
若低于1.7說(shuō)明可能有蛋白污染。OD260/OD280比值若高于2.0則說(shuō)明
DNA有可能已降解。如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子
水，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子濃度會(huì)影響光吸收值，但并不表
示純度低。