NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）試劑盒 說明 技術文章

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NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）試劑盒

商品貨號：QS1002
英文名稱：NAD-Malate Dehydrogenase（NAD-MDH）Assay Kit
別名：NAD-蘋果酸脫氫酶試劑盒 NAD-MDH Kit NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）試劑盒 NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）測試盒
檢測方法：常量法

產品詳細介紹

測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH，細菌中通常只含有NAD-MDH，在真核細胞中，NAD-MDH分布于細胞質和線粒體中。

測定原理：

NAD-MDH催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致340nm處光吸收下降。

產品說明書

貨號：QS1002          規(guī)格：50 管/48 樣

  NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）試劑盒說明書 紫外分光光度法

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，線粒體中 MDH 是 TCA 循環(huán)的關鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中 MDH 催化草酰乙酸形成蘋果酸。 草酰乙酸是重要的中間產物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH 在細胞多種生理活動中 扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病 性等。根據不同的輔酶特異性，MDH 分為 NAD-依賴的 MDH 和 NADP-依賴的 MDH，細菌中通常只 含有 NAD-MDH，在真核細胞中，NAD-MDH 分布于細胞質和線粒體中。

測定原理：

NAD-MDH 催化 NADH 還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致 340nm 處光吸收下降。

自備實驗用品及儀器：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一: 提取液 60 mL×1 瓶，在 4℃保存；

試劑二: 液體 50 mL×1 瓶，在 4℃保存；

試劑三: 粉劑×2 支，-20℃保存；臨用前加入 300μ L 蒸餾水，充分溶解待用；用不完的 試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑四: 粉劑×2 支，-20℃保存；臨用前加入 300μ L 蒸餾水，充分溶解待用；用不完的 試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

樣本測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴ 個）：試劑一體積（mL）為 1000~5000：1 的比例（建議 2000 萬細菌或細胞加入 1mL 試劑一）， 超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃ 離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、將試劑二在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。

3、操作表：

將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，混勻后立即在 340 nm 波長下記錄初始吸光度 A1 和反應 1min 后的吸光度 A2，計算 ΔA=A1-A2。

注意：若 A1-A2 大于 0.5，需將樣本用提取液稀釋，使 A1-A2 小于 0.5，可提高檢測靈敏度。 計算公式中乘以相應稀釋倍數。

NAD-MDH 活力單位的計算：

1、血清（漿）NAD-MDH 活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mL）=[Δ A×V 反總÷（ε ×d）×10⁹ ]÷V 樣÷T=6430×Δ A

2、組織、細菌或細胞中 NAD-MDH 活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH （ nmol/min/mg prot ） =[Δ A×V 反 總 ÷ （ ε ×d ） ×10⁹ ]÷(V 樣 ×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[Δ A×V 反總÷（ε ×d）×10⁹ ]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T =6430×Δ A÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。 NAD-MDH（nmol/min/104 cell）=[Δ A×V 反總÷（ε ×d）×10⁹ ]÷（2000×V 樣÷V 樣總） ÷T=3.215×ΔA

V 反總：反應體系總體積，8×10^-4 L；ε ：NADH 摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應 時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；2000：細胞或細菌總數，2000 萬。 

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